细胞实验的成败，往往始于对“生死”的精准判断。 在细胞培养的世界里，细胞的状态直接决定了实验的成败。无论是复苏、传代还是药物处理，我们都需要第一时间掌握细胞的“生死”情况。今天， 我们就来聊聊如何在显微镜🔬下，快速、准确地判断细胞是“死”还是“活”。
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一、形态学观察：显微镜🔬下的“第一印象”
在未染色的情况下，通过普通光学显微镜🔬观察细胞形态，是判断细胞状态最直接、最快速的方法。虽然这种方法主观性较强，但经验丰富的实验者 往往能通过“第一印象“做出初步判断。
1.活细胞：生机勃勃的“小圆饼”
- 形态饱满： 活细胞通常呈圆形或椭圆形，形态规则，边缘清晰，像一个个饱满的小圆饼。
- 折光性强： 由于细胞膜完整且细胞质密度均匀，活细胞在显微镜🔬下具有较强的折光性，看起来明亮、透亮。
- 贴壁良好： 对于贴壁细胞，活细胞会牢牢地“趴“在培养皿底部，形态舒展(如成纤维细胞呈梭形),细胞核清晰可见。
（RAW264.7货号：FH0328）
2.死细胞：黯淡无光的“残骸”
- 形态异常： 死细胞往往失去正常形态，可能变得皱缩、肿胀或破裂。
- 折光性弱： 死细胞的细胞膜通透性增加，内容物可能泄漏，导致折光性变差，看起来黯淡、发黑，甚至呈颗粒状。
- 漂浮或脱落： 死细胞无法正常贴壁，常漂浮在培养液中，或轻轻一吹打就从皿底脱落。
注意： 形态学观察虽然方便，但无法精确量化，且对于早期凋亡或状态不佳的细胞容易误判。因此，它通常作为初步筛查手段，更精确的判断还需 要依赖染色法。
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二、 台盼蓝染色法：最经典的“生死判官”
台盼蓝染色是实验室最常用、最经济的细胞活性检测方法，原理简单，操作快捷。
1.核心原理：膜完整性是“生死线”
- 活细胞(拒染):活细胞的细胞膜结构完整，具有选择透过性，能够排斥台盼蓝染料进入。因此，在显微镜🔬下，活细胞无色透明，保持原有形 态。
- 死细胞(吸染):死细胞的细胞膜完整性丧失，染料可以自由进入细胞内部，与细胞内容物(如DNA🧬) 结合。因此，死细胞会被染成均匀的蓝 色。
2.操作要点与判读
- 混合：将细胞悬液与0.4%的台盼蓝染液按9:1或1:1比例混合，轻柔吹打混匀。
- 计时：室温孵育1-5分钟 (严格计时!时间过长活细胞也会被染色)。
- 观察：滴加至血细胞计数板，显微镜🔬下观察。
活细胞：小而圆，无色透明，折光性强。
死细胞：体积可能稍大，深蓝色，无折光性。
（Hela细胞台盼蓝染色图片）
3.严谨的注意事项
- 时间窗口：染色时间必须严格控制。超过5分钟，活细胞可能因染料渗透或细胞损伤而开始着色，导致活率计算偏低。
- 区分碎片：视野中可能有一些不规则的蓝色小颗粒，这些是细胞碎片，不应计入死细胞总数。死细胞应是完整的圆形蓝色细胞。
- 血清干扰：染色前最好用PBS清洗细胞，去除残留的血清，因为血清中的蛋白可能与染料结合产生背景干扰。
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三 、 荧光染色法：更精准的“双色标记”
当需要更高灵敏度或区分凋亡与坏死时，荧光染色法是更优的选择。它利用不同荧光染料对活死细胞的选择性结合，在荧光显微镜🔬下呈现鲜明的颜 色对比。
1.钙黄绿素-AM (Calcein-AM)/ 碘化丙啶(PI) 双染法
这是目前最主流的荧光活死细胞检测方法，被誉为“金标准”。
- 活细胞(绿色): Calcein-AM本身不发荧光，但能自由穿透细胞膜进入活细胞。活细胞内的酯酶会将其水解成Calcein,后者不能穿透细胞膜而被 “锁”在细胞内，发出强绿色荧光。
- 死细胞(红色): PI是一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜。只有当细胞膜破损(死细胞)时， Pl才能进入细胞核与DNA🧬结合，发出红色荧光。
- 结果判读：在荧光显微镜🔬下，视野中绿色的是活细胞，红色的是死细胞，一目了然，且可以进行精确定量分析(如流式细胞术)。
（PBMC荧光染色图片）
2.其他荧光染料
·Hoechst/DAPI: 这两种染料主要与DNA🧬 结合，发出蓝色荧光。它们通常用于标记细胞核。需要注意的是，它们能穿透所有细胞的膜，因此不能 单独用于区分死活，常与其他染料(如PI)联用，或在固定细胞后使用。
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总 结
判断细胞死活，是细胞实验的基本功。在日常工作中，我们可以遵循以下流程：
1.第一步(粗筛):先用普通显微镜🔬看形态，如果视野里细胞透亮、贴壁好，说明状态不错。
2.第二步(定量) :如果需要精确计算存活率(如冻存复苏后),使用台盼蓝染色，3分钟内完成计数。
3. 第三步(精研):如果研究细胞凋亡或需要高精度成像，使用Calcein-AM/PI双染，在荧光显微镜🔬下获取最可靠的数据。
记住，无论哪种方法，严谨的操作 (如控制染色时间、轻柔吹打)和准确的判读 (区分死细胞与碎片)都是获得真实数据的关键。
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