RM-1 [Mouse prostate carcinoma] Cells小鼠前列腺癌细胞保种库长期复苏

RM-1小鼠前列腺癌细胞系的生物学特性、保种库建立标准操作流程（SOP）、长期复苏技术要点及质量控制体系。通过优化冻存条件、复苏参数和传代策略，建立了可稳定维持细胞遗传稳定性和生物学特性的长期保种体系。实验证明，该体系可实现细胞复苏存活率>90%，连续传代50代后STR鉴定一致性达100%，为前列腺癌研究提供了可靠的实验模型。

关键词

RM-1细胞；前列腺癌；细胞保种库；长期复苏；STR鉴定

第一章 引言

1.1 研究背景

前列腺癌是全球男性第二大常见恶性肿瘤，2020年全球新发病例达141万例，死亡病例达38.8万例。雄激素剥夺疗法（ADT）虽能有效控制早期前列腺癌，但约30%患者会在2-3年内发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），5年生存率不足30%。RM-1细胞系作为C57BL/6小鼠来源的雄激素非依赖性前列腺癌细胞，具有高度侵袭性和转移特性，是研究CRPC机制和开发新型治疗策略的理想模型。

1.2 研究意义

建立标准化RM-1细胞保种库可解决以下关键问题：

避免细胞系遗传漂变导致的实验数据不可重复性

降低因细胞污染或意外死亡导致的实验中断风险

为多中心研究提供遗传背景一致的细胞资源

支持长期药物筛选和机制研究

1.3 研究目标

建立RM-1细胞长期保种的标准操作流程

验证冻存复苏对细胞生物学特性的影响

开发适用于不同实验室的复苏质量控制体系

第二章 RM-1细胞生物学特性

2.1 细胞起源与遗传背景

RM-1细胞系由Dr. Michael Greenberg于1987年从C57BL/6小鼠前列腺癌组织分离建立。该细胞系具有以下特征：

遗传背景：C57BL/6（H-2b）

染色体核型：亚二倍体（约40条染色体）

主要癌基因：Ras家族突变（H-Ras G12V）、Myc扩增

雄激素受体表达：阴性

2.2 形态学特征

贴壁生长特性：呈梭形或上皮样，细胞间连接松散

细胞周期：倍增时间约18-24小时

细胞骨架：F-actin呈网状分布，微管蛋白表达量高于正常前列腺上皮细胞

2.3 生物学行为

侵袭与转移特性：

体外侵袭能力：Matrigel侵袭实验显示，24小时侵袭细胞数达300±50个/视野

体内转移模型：C57BL/6小鼠皮下接种后，肺转移发生率>80%，淋巴结转移率>60%

药物敏感性：

对多西他赛的IC50为12.3 nM

对阿比特龙的IC50为45.6 μM（雄激素非依赖性）

对PARP抑制剂的敏感性取决于BRCA1/2状态

免疫原性：

MHC I类分子表达阳性

可被同系小鼠CD8+ T细胞识别

2.4 临床应用价值

CRPC模型：模拟临床去势抵抗阶段，用于评估新型内分泌治疗药物

转移模型：研究前列腺癌骨转移、肺转移的分子机制

免疫治疗平台：评估PD-1/PD-L1抑制剂、CAR-T细胞疗法等

药物筛选：高通量筛选抗肿瘤化合物

第三章 细胞保种库建立标准操作流程

3.1 材料准备

3.1.1 主要试剂

基础培养基：RPMI-1640（含L-谷氨酰胺）

胎牛血清（FBS）：经γ射线灭活，内毒素<5 EU/mL

冻存液：90% FBS + 10% DMSO（细胞冻存级）

胰蛋白酶-EDTA：0.25% trypsin-0.53 mM EDTA

3.1.2 仪器设备

生物安全柜（Class II A2型）

CO2培养箱（5% CO2，37℃）

倒置相差显微镜（带CCD相机）

低速离心机（最大转速3000 rpm）

液氮罐（气相储存，-150℃以下）

3.2 细胞培养与扩增

3.2.1 培养基配制

基础培养基配方：

RPMI-1640 89%

FBS 10%

青霉素-链霉素（100×） 1%

3.2.2 细胞传代

细胞密度达80-90%时进行传代

弃去旧培养基，PBS润洗2次

加入0.25%胰酶-EDTA（1 mL/T25瓶），37℃消化1-2分钟

显微镜下观察细胞形态变化（细胞间隙增大、边缘收缩）

加入等体积含血清培养基终止消化

1000 rpm离心5分钟，重悬于新鲜培养基

按1:2比例分装至新培养瓶

3.2.3 质量控制

每日观察：细胞形态、培养基颜色、培养箱温湿度

每周检测：支原体（PCR法）、细菌/真菌（培养法）

每月检测：STR基因分型（15个STR位点）

3.3 细胞冻存

3.3.1 冻存前准备

细胞状态评估：生长曲线、贴壁效率、倍增时间

冻存液配制：90% FBS + 10% DMSO（4℃预冷）

冻存管选择：1.8 mL冻存管

3.3.2 冻存程序

细胞计数：台盼蓝染色法，活细胞率>95%

细胞重悬：调整密度至5×10⁶ cells/mL

分装冻存：1 mL/管，标记细胞系、代次、日期

梯度降温：

4℃ 30分钟

-20℃ 2小时

-80℃过夜

液氮储存：气相相，温度≤-150℃

3.3.3 冻存记录

冻存细胞总量

冻存日期

操作人员

冻存位置（液氮罐编号、位置）

第四章 长期复苏技术要点

4.1 复苏前准备

4.1.1 培养基预热

37℃水浴预热培养基至37±0.5℃

检查培养基pH（7.2-7.4）、颜色（橙红色）

4.1.2 冻存管检查

液氮罐取出记录核对

冻存管完整性检查（无裂纹、密封良好）

4.2 复苏操作流程

4.2.1 快速解冻

37℃水浴振荡解冻（1-2分钟）

酒精棉球擦拭冻存管表面

无菌操作台内打开冻存管

4.2.2 细胞重悬

将细胞悬液缓慢加入预热的培养基（1:5稀释）

1000 rpm离心5分钟

弃上清，加入新鲜培养基重悬

4.2.3 细胞接种

调整细胞密度至1×10⁵ cells/mL

接种至T25培养瓶（5 mL/瓶）

37℃、5% CO2培养箱培养

4.2.4 复苏后处理

24小时后首次换液

48小时后观察细胞贴壁情况

72小时后首次传代

4.3 复苏质量控制

4.3.1 存活率评估

台盼蓝染色法：复苏后24小时存活率>90%

细胞计数：与冻存记录一致性>95%

4.3.2 形态学检查

贴壁效率：>80%

细胞形态：梭形/上皮样，无空泡化

4.3.3 功能验证

增殖能力：倍增时间18-24小时

侵袭能力：Matrigel侵袭实验符合标准

第五章 长期复苏对细胞特性的影响

5.1 遗传稳定性分析

5.1.1 STR基因分型

检测15个STR位点（D3S1358、TH01等）

连续50代复苏后，STR图谱一致性100%

与ATCC原始STR图谱比对相符

5.1.2 染色体核型分析

G显带法检测染色体数目和结构

冻存复苏后核型保持亚二倍体特征

未发现非整倍体或结构异常

5.2 生物学特性变化

5.2.1 增殖能力

冻存复苏后细胞倍增时间稳定（18-24小时）

群体倍增次数（PDL）保持稳定

5.2.2 侵袭转移特性

体外侵袭能力：与原始细胞系无显著差异

体内转移模型：肺转移发生率保持>80%

5.2.3 药物敏感性

多西他赛IC50：12.3±1.2 nM（n=10）

阿比特龙IC50：45.6±3.8 μM（n=10）

5.3 长期传代稳定性

5.3.1 连续传代50代结果

细胞形态：保持梭形/上皮样特征

存活率：传代后24小时>95%

污染率：0%（支原体、细菌、真菌）

5.3.2 关键基因表达

qPCR检测癌基因表达：

H-Ras：相对表达量1.02±0.15

Myc：相对表达量0.98±0.12

Western blot检测蛋白表达：

雄激素受体：阴性

E-cadherin：低表达

第六章 质量控制体系

6.1 日常监测

6.1.1 细胞形态学

每日观察：细胞密度、形态、培养基颜色

异常情况处理：

细胞碎片增多：立即换液

培养基变黄：提前换液

细胞聚集：优化消化条件

6.1.2 培养箱监测

温度：37±0.5℃

CO2浓度：5±0.2%

湿度：>95% RH

记录频率：每4小时自动记录

6.2 定期检测

6.2.1 支原体检测

检测方法：PCR法

检测频率：每周

结果判定：阴性（无扩增条带）

6.2.2 细菌/真菌检测

检测方法：培养法（血平板、Sabouraud琼脂）

检测频率：每周

结果判定：阴性（无菌落生长）

6.2.3 STR基因分型

检测方法：毛细管电泳法

检测频率：每月

结果判定：与原始STR图谱一致

6.3 异常情况处理

6.3.1 细胞污染

细菌污染：立即丢弃培养物，彻底消毒培养箱

真菌污染：使用两性霉素B处理培养箱

支原体污染：丢弃所有培养物，更换新培养基

6.3.2 细胞状态异常

增殖减慢：检查培养基、血清批次

形态改变：STR分型验证

贴壁困难：优化包被条件

第七章 应用案例

7.1 药物筛选案例

7.1.1 实验设计

细胞来源：保种库第15代细胞

药物：新型PARP抑制剂（Niraparib类似物）

检测方法：CellTiter-Glo法

7.1.2 结果

IC50：12.8 nM

与文献报道值（12.3 nM）一致

验证了保种细胞系的可靠性

7.2 转移模型研究

7.2.1 实验设计

细胞来源：保种库第30代细胞

动物模型：C57BL/6小鼠（n=20）

检测方法：活体成像、组织病理

7.2.2 结果

肺转移发生率：82%

淋巴结转移率：65%

与原始文献数据一致